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亦可用于种间分析;RNA基因进化很慢

来源:未知作者:admin 更新时间:2019-10-08 11:31
1.本站不保证该用户上传的文档完整性,不预览、不比对内容而直接下载产生的反悔问题本站不予受理。 髅号 栅 UDc ⑧ 研究生学位论文 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎 线粒体DNA控制区结构的初步研究 珊幽蟪 圈童互 躺撕馘建螳皴 耕靴吲 亟土 制E磅拯幽堂 逝嘴

  1.本站不保证该用户上传的文档完整性,不预览、不比对内容而直接下载产生的反悔问题本站不予受理。

  髅号 栅—— UDc ⑧ 研究生学位论文 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎 线粒体DNA控制区结构的初步研究 珊幽蟪 圈童互 躺撕馘建螳皴 耕靴吲 亟土 制E磅拯幽堂 逝嘴辨日搠垫Q堕笙§且!垒旦学l搬予日期2Q鳗堡§旦 中国薄洋大学 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎线粒体DNA控制区结构的 初步研究 摘 要 rRNA、12S 已有学者通过分析16S rRNA基因和细胞色素B(cyt一6)基因对鳎科 一些属间种问的系统学关系进行研究。迄今,未见利用分子生物学手段研究舌鳎 科系统学关系的报道。 本文对7种鳎亚目(Soleoidei)鱼类线SrRNA基因片段和C01基因 片段进行了序列比较和分子系统学分析。PCR扩增和测序得到长度为525bp的16S rRNA基因序列和633bp的COI基因序列。7种鳎亚目鱼类线SrRNA基因 片段中共检测到173个变异位点,鳎亚目舌鳎科6种鱼线粒体COI基因片段中共 检测到201个变异位点,舌鳎科6种鱼在COI基因序列中变异位点的比例 (31.75%)高于16SrRNA基因片段中变异位点的比例(23.05%),认为COI基因 片段与16SrRNA基因片段相比为较灵敏的序列标记。根据16SrRNA基因和C01 基因序列变异所得的种间、亚属及属间的平均遗传距离分别是0.0892、0.1739、 遗传距离,因此,我们认为舌鳎科具有更多属的阶元划分的可能性。另外,根据 16S rRNA基因和COI基因序列变异计算所得的紫斑舌鳎与短吻三线和 平均遗传距离分别为0.0021和0.0016,种内的平均遗传距离分别为0.001 0.0016,种间遗传距离与种内遗传距离相近,所以,两种片段都不能将这两个种 分开,但由于他们的形态特征存在细微差别,要断定它们是否为同种异名,还需 更多的分类依据。根据16S 和MP法所构建的系统树有一共同点:舌鳎属三线种鱼先与须鳎属的 曰本须鳎聚类为一枝,然后再与舌鳎属舌鳎亚属的中华舌鳎聚类,这一结果支持 rRNA基因和COI 舌鳎科具有更多属的阶元划分的可能性的假设。根据线种鳎亚目鱼类系统学关系,结果分析表明这两个片段适用于 鳊髓目鱼类系统学关系投带纹条鞠线粒体DNA控制区缩构的初步研究 耱及;}孛良上除元瓣系统学关系的研究,筏在一些形态分类中已存在争议豹透缘种 关系的研究中缺乏说服力,需臻寻找更加合适的基因片段作为研究对蒙。 本文对鳎驻酱鳎科条鳎属带纹条鳎(Zebriaszebr;?)的控制区全序捌进行了 鱼mtDNA控制熬包括三令主要识别区域;扩震终止摺关序到、中央保守房列区、 保守序列区,在不同的种类间存在大致相同的保守区段:ETAS结构,CSB—D、 构很保守,而CSB—F、CSB—E、CSB一2、CSB 3种间存在个别碱基的变异,种内未 发现变异。Lee等帮Guo等己缀对一登绦守区懿功能俸邋候设,僵这些像守区浚 的作用功能还商待更深入的研究。 关键词:鳎亚强;16SrRNA基因;col基因;分子系绞掌;r睦DNA控粼送结构 望垩璺璺鲞墨竺篓鲞至墨要墼墨望璧些堡里望全塑型曼竺!苎!塑塑生竺塑 Pilot for ofSoleoideifishesand Study Phylogeneticanalysis Structure ofZebriaszebramtDNAcontrol region Abstract PleuronectiformesSoleoideiinctudesSoleidaeand family familyCynoglossidae, Thereare31 and120 in thereare3 mad127 genus speciesfamilySoleidae,and genus in scholarshave studied of speciesCynoglossidae.Some phylogeneficrelationship Soleidaebasedon16SrRNA 2SrRNA and species gene,1 genecyt.bgene.Hitherto, itisnot thatsimilarmethodshavebeenusedin of reported phylogeneticanalysis Cynoglossidaespecies. Inthis of7Soleoideiare study,phylogenetlcrelationship speciesanalysedby variationofboth16SrRNA andCOI sequence gene gene.PCR amplification and each areobtainedand products 633鄱for of525bp gene these are ClustalXwithJenkinsia as sequencesaligned using lamprotaeniaoutgroup. and variationwereexamined Basepaircompositionsequence accordingly.One hundredand threevariationsiteswere seventy detectedin7Soleoidei species,and 201variationsitesweredetectedinCynoglossidaespecies.The ofvariable percentage withinthe ofCOI positions 633bppartialsequencegene(31.75%)is thanthat higher within the of16SrRNA 525bppartialsequence gene hasa resolution with16SrRNA asa markerat higher compared gene phylogenetic leastinSoleoidei distancesof16SrRNA phylogeny.Theaveragegenetic gene between and are whilethatofCOI genus0.0892,O.1739,O.1621 species,subgenus areO.1182、0.2223、O,2190 isto gene respectively.Thatsay,the averageintergenerie than distanceis smaller distance itis irregularly genetic amongsubgenus,assuggests that beclassified possiblefamily may tomuchmoretaxaonthebase Cynoglossidae of currentclaSsification. the distanceof Moreoveg interspecific abbreviatusand calculated C》noglossus翻reliscus) c埘.)purpureomaculatus tositevariationsof16SrRNA and are COl O.0021andO.0016 according gene gene distance ofthe respectively,whileaverageintraspecificgenetic according sequence two areO.0011 andO.0016.Asaresult.itistooclosebetween and genes interspecific distanceto and intraspecific distinguish either16SrRNA orCOI C.《A.)purpureomaculatusmerelybyanalyzing gene gene. 3 冁亚丑鱼类系筑学关豢及带绽条鳎线裢体DNA控铡鲢臻构粒劫步磷宠 isofalittle tocharacterizethemasthesame ollaccoul_lt Hov,ever,it arbitrary specie ofthesubtledistinction013 morphology. treesareconstructedwith as Phylogenetic 01.1amprotaeniaoutgroupusing andMPmethods both1 UPGMA,NJ,ME 6SrRNA respectively.From gene andCOI Callbe seenthat4 of dendrogram,it dendrogram clearly species inthesame with Cynoglossus翻、,clusterclade and ofthem then,all withe japonica puttogether,group Thisresultalso the thatthere bemore or supportssuggestion may genussubgelms taxain thancurrelat 6SrRNA andCOl Cynoglossidaeagreement.Ingeneral,1 gene at areusefultoolsfor ofSoleoideifishesthelevelof analysis gene phylogenetic or itisnotconvictiveforthem specieshiger-level,whereas enough todiainguish related and markerwith morphologicallyclosely speciesphylogenetic higher be resolutionshouldfu/e.her developed. ofZebriaszebramtDNAcontrol is and Completesequence regionamplified witll reinhardtiusand otivaceus Paralichthys comparedsequencesofHippogtossoides downloadedfromGenBank.In conservedofthesethree analogy,the regions species as areidentified andeS嚣o. E强S,CSB—D,CSB—ECSB—E,GTGGG·玟)x,CSB一2 The ofCSB—DandGTGGG—boxare conservedwhileafew sequences stringently site in vailatiOilsarefoundother functionofthese is regionsamongspecies,The ix季ons stillinthePandora’sBox. rRNA analysis; Keywords:Soleoidei;16Sgene;COlgene;phyiogenetie structureofmtDNAcontrol region 4 鳎亚目煎类系统学关系及带绞条鳎线粒体DNA控制区结构鼬初步研究 1前言 “垂达尔文錾孪{℃起,诲多生戆学家鬈有令梦想,露矮蔻重建造球上所有生命 的进化历史并以系统树的形式描述这部历史。”(Haechel,1866)近几十年来, 生命科学及稆关学科静不颧发展稻相互渗透,尤其强分子生物学技术和谤算机技 术的飞速发展和广泛应用,为系统册进化生物学研究带来了前所束有的发展,促 避了分子系统学的迅速发展。 1,1分子系统学概述 分予系统学蔻用分子生物学的技术和方法来磷究生韵多祥性,暖及它们之间 相互关系的科学。它主要包括两个领域,即霉申群遗传学和系统发生学,前嚣主要 研究种内分化,后者主要研究物种多样性及种间系统发生。分子系统学研究的主 要霹标是根据分予生物学数据掏建系统发生树,进薅推颤出菜一特定类嚣系统发 et 生的分支模式(Swoffordal,1996)o 20繁缎50年代鹚麓,德鏊Hennig掇瞧了系绞发生掌,帮辕炎群系绫发生 关系进行分类的新理论。假由于种种原因,直到60年代中期,这一新的分类方 统举,其主露分析方法——分支分析广泛应用于系统与进化生物学研究及相关领 and 支分柝业融成为分子系统学中最亟要的数据分撰方法(Swofford01sen, 1990:Swoffordetal,1996)。 {.{。{基穑漂瑾 分子系统学的理论依据为:(I)生命的生化一致性和多样性原理:(2)生物 大分子进化恒定憔原理:(3)表信息分子(次生代谢物质)的进化原理:表信息 分子是生物进化的产物,冀进化是与l弋落途径樱关联鲍,它是基爨挺在分子承乎 上的表现型。这个原理是袭信息、分子系统学研究的遗传熬础和依据。 分予系统学的方法基懿受:(1)霞源魄较器理;(2)襻鑫同囊瞧凝理(黄覆, 】998)。 鳎捱目鱼类鬈袭学关系救带纹条鲻线粒体DNA控钱匿结构的初步嘏究 {.12主要研究方法 l。1.2。l蛋自屡东平隐标记与捻测 20世纪50一60年代,分予系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。它有 两个筑点:(I)位点交亿莳魏律可嗣经验摸黧描述,最著名静蓬Dayhoff模聚 et (Dayhoffal,1978)。(2)即使在密码子偏好性显著不同的物种问,亦未发 现有明显的氨蒸酸偏好性。僵怒,与核酸序列相比,氨基酸序列的信恿量较少。 核酸中的某些变化(如澍义突燹)在掇应的蛋国质序列中反应不出来。因面有入 etal, 1990)。 主张核酸序列照好(Meyer A.羁工酶积等霞酶电溶 此方法可以在相对较短的时间内梭测出大量样本中许多座位上的遗传变异, 在耱群求平上裣溯遗传交舅浚遥有效,方便节键。毽它貔缺点楚冒秘溺弱遗传位 点数掇较小,只能检测编码酶簧白的基因位点,对非编码基因的变异则滗能为力: 同时,密码予阍义突交酶广泛存在使之无法检测全部的DNA交舜,因丽低估遗传 etal,1998),进 变异水平,藕且等位綦因位点易受选撵压力的影响(Poteaux 一步降低了它用于估计遗传交弊的精确性,因而根据等位酶数据实现系统发生爨 et 建豹谖毅力籀慰较弱(Semerikoval,1999)。 B.蛋自质立体结构测定 邋年来溅定蛋叁笈戆立钵结褥或必获褥分子系统举售患鹣赣技零。由于蛋鑫 质高缀结构的进化比一级结构要保守,因此根据高级结构建立的系统发生关系熙 翘可黎。生穆大分子的空闯立体结构袋能准确爱陕系统演铯关系,涎蔫技术静不 断进步,蛋白质立体结构分析在分子系统学上必将得到广泛的应用。 l。l。2+2 DNA水平躲标记与检测 20世纪70年代,分子系统学研究进入了犊酸水平时期,80年代以来,以聚 增多恣性DNA技术、DNA指纹图谱技术和扩增片段长发多态性技术等,近几年米 又发媵了微卫星DNA指纹图谱技术及核酸序列测定技术,分予系统学在DNA水平 豹五耍究飞速发展并取褥了大蘩显萋搜成粟。 6 鳎亚目擞娄系统学燕系及带跛条鳎线粒体DNA挎制睦结构的初步研究 (1)分子标记技术(间接方法) A.隈毒l性渴弼酪片段长凄多态性技术 po]ymorphism,RFLP) 结槊稳定可靠、重复性好,不受环境及物种发育阶段影响,但特异掇针较难得到、 步骤多、操作过程复杂、周期长,对DNA的需要量大,因而在分子系统发生方面 的应用相对较少。 B.扩增片段长度多态性技术(amlifledfragment1ength et a1.1993),既有RFLP的可靠性,又有RAPD的灵敏度。但在分子系统发生的研 究中,谈按术显霉较为繁壤,函孺未靛广泛采嗣。 DNA,RAPD) C.随机扩增多态性DNA(randomamplylifiedpolimorphic et 静建立在PCR技术基础上魄分子标记手段(Welishal,1990)。P,hPD标记 不需要预先知道任何DNA序列信息,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成 一套随援弓l甥可弱予不同垒貔基爨缀分橱。该方法霹嗣霹捻测多今建点,虽鬻掌 是RFLP标记不能梭测到的熏复序列区。但RAPD标记是一种显性标记,不能有效 遗签定密杂合予,量RAPD瓣反应条静镶戆,实验熬重复靛差,结莱难疆瓣释, 这是RAPD技术目前在应用上存在争议的原因。 D.徽卫星DNA指纹图谱技术 repeat,SSR),在 微卫星DNA也称简单串联重复序列(simplesequence 所有真核生物基因组中随机分布,豳于重复次数和糨度的不同使所在的基阂座位 肇现一定鲶多态鼗。微卫攫DNA的重复在基因缓的进化孛起着{}卷重要懿{擘用 (Charlesworthetal,1994),因而,被认为是遗传信息含量最高的遗传标记 (Bowcocketal,1993)。镞至星DNA在蒸因缍中多态洼囊,著显等往基因数奢 多,呈等舅性遗传,其指纹图谱有极高的多态性,结果稳定可靠,蘑复性好,适 用于任何囊孩生物的系统发生磅究。但是徽卫星座位突变梳率高,对变异瘦应摄 其灵敏,所以易受至n趋同变异引起的平行演化程度的影Ⅱ晦(黄京飞等,1997), 从而给物;}中间亲缘关系的评估带来误差。 鲻亚蟊鱼裘系统学蓑蓉及带鎏条鲻线粒体DNA控裁嚣络擒酶褪步辑究 (2)核羧序捌测定(纛绥方法) 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成涞比较同源分子之间相关性的方 法郎为核酸序列分毒厅宠法。壹羧溺定DNA序歹l可以测出绣有的DNA交菇,驮焉溺 得最为准确的遗传信息、,但是这一技术耗资较大。而且序列数据本身存在的移 重替换问题、协同进化问题和序到进化速率的变异等问题以及数据分褥中的序列 比对方法的不足都令它在目前应用中受到一定的影响。动植物的基因组十分魔 大,除了一些模式生物外,对DNA的全序列分析,尤其是对种群的遗传多样性枪 测还楚存在嚣难熬(Arise,1994)。 目前,系统学研究中常用的基因序列主要有线粒体DNA和核糖体RNA等。线 粒体DNA是Nass等1962年发溪的。动耱线粒体睬盎楚絷垂髂羚速转秘壤,殴接 价闭合的环状双链DNA存在。核糖体RNA基因是高度复制的串联序列单位,它由 其中内转录间隔区是核基因组中进化较快的DNA片段,由于ITS区序列在科以下 阶元的分类中有非常明显的优势,而18S序列的高度傈守性,使它成为科以上水 平系绞演化磷究中豢袋用的基因痔列。 {.1。3系统树的构建 对DNA序列进行系统发生分析的主要步骤是:序列比对、建立取代模型、建 立进化树以及进化树评估。系统发生的发生过穗都是融经发生并完成的历史,所 毫豹续论都是建立在接錾或者浮售弱罄础上豹,_i嚣无法实现真正数霉域。建树的 方法主要有躐离法和特征法,距离法的代表性方法为不加权算术平均组对法 (UPG融)察舔按法(NJ)。特餐法孛最常采弱熬跫最大麓约法(凇)帮最大觳然法 (ML)。 1.1.3.1模整的发展 瓣予霜源净列系统发育分摄来说,实际上掰有用模型来撼述序列进位豹方法 不外乎由两个方面构成:系统发生树和描述由于核苷漩或氨基酸替换引起的序列 遘佬方式。这耱替换鬻誊疆认惫是褒然突交事{孛的产镶,嚣曼毽稻在撼一彦刭位 点的发生率怒通过Markov过程来模拟的。通常地,相同的Markov过程被运用于 每一序掰位纛,不同静模型之游的区涮在于谴惦静暇设或者怒考虑了掰有可麓誊 鳎亚目鱼裘系统学天系及带纹景鳎线粒体DNA控昔怄结构的初步研究 (2)核皱序列测定C直接方法) 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方 法即为核酸序列分析方法。直接测定DNA序列可以测出所有的DNA变异,从而铡 得最为准确的遗传信息、,但是这一技术耗资较大。而且序列数据本身存在的多 重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据分析中的序列 比对方法的不足都令它在目前虚用中受到一定的影响。动植物的基因组十分庞 大,除了一些模式生物外,对I)NA的全序列分析,尤其是对种群的遗传多样性检 测还是存在嗣难的(Arise,1994)。 目前,系统学研究中常用的基因序列土费有线粒体DNA和核糖体RNA等。线 粒伴洲A是Nass等1962年发现的。动物线粒体DNA是染色体外遗传物质,以共 价闭合的环状双链DNA存在。核糖体RNA基因是高度复制的串麟序列单位,它由 其中内转录间隔区是核基因组中进化较快的DNA片段,由于ITS区序列在科阻下 阶元的分炎中有非常明显的优势,而】8s序列的高度保守性,使它成为科以上水 平系统演化研究中常采用的基因序列。 1 1.3系统树的构建 对DNA序列进行系统发生分析的主要步骤是:序列比对、建立取代模型、建 立进化树以及进化树评估。系统发生的发生过程都是已经发生并完成的历史,所 有的结论都是建立在推断或者评估的基础上的,而无法实现真正的再现。建树的 方法主要有距离法和特征法,距离法的代表性方法为不加权算术平均组对法 (ML)。 1.1.3.1模型的发展 对于同源序列系统发育分析来说,实际上所有用模型来描述序列进化的方法 不外乎由两个方面构成:系统发生树和描述由于核苷酸或氢基酸替换引起的序歹4 进化方式。这种替换常常被认为是偶然突变事件的产物,而且他们在每一序列位 点的发生率是通过№rkov过程来模拟的。通常地,相同的Markov过程被运用于 每一序列位点,不同的模型之间的区剐在于他们的假设或者是考虑了所有可髓营 每。序列位点,不同的模型之间的区剐在于他们的假设或者是考虑了所有可麓替 鳎Ⅱ目鱼类系统学关系及带纹条鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 换的平均发生率参数。现在己经有了更加复杂的模型,这些模型根据各种不同的 生物现象来描述替换率,并且对序列进化方式赋予了一个更适合的模型(Adachi et et 率给予一个更精确和强有力的估计(Yangal,1995)。目前,更精确的序列 进化模型的发展是近年来一个特别活跃的研究领域,因为更完善的模型会改进系 统发生推论并能更好的理解分子进化。 现在有两种建立序列进化模型的方法。一种是建立经验模型,也就是通过比 较大量序列来进行特性计算。例如,简单地计算明显的替换。但在许多密切相关 的序列中(也就是亲缘关系近的序列),经验模型会导致固定的参数值,因为这 个参数值仅仅是通过一次计算得来,却运用于其他所有数据,这使他们在计算上 非常容易,但使用这些模型却要非常小心,因为运用这样的模型所得到的结果可 能是错误。另一种是根据DNA或氨基酸生物和化学特性构建参数模型。例如,结 合参数来对DNA序列转换和颠换替代频率的描述。参数化的模型允许参数值来自 于每次分析的数据集。从以上这些来看,在任何进化时间和任何位点上(Swofford et al,1996),对于任何从一种核苷酸变到另一种核苷酸的可能性(也包括那些 保持不变的可能性),多数的模型都假定这个矩阵的可逆性,也就是说,进化过 程就像事物会向前发展一样也会适时地倒退。比如,在一条序列中观察到有一个 A变到另一序列中的T与观察到后一序列的T变到前一序列的A具有相同的可能 性。 DNA替代模型:DNA进化的模型主要集中在参数的选择上。现在主要有三种 类型的参数:l碱基频率参数;2碱基替代参数;3速率异质性参数。碱基频率 参数描述的是碱基A,c,G和T的频率。这些参数代表了诸如Gc含量这种影响 碱基频率的限制因素,这个参数在某一模型中扮演着加权因子的角色,并通过使 某一碱基更可能出现而起作用。碱基替代参数描述的是碱基替代的相对趋势,体 现碱基频率影响。这些参数代表了一种碱基生化相似性的量度:相似性越大,发 生替代的可能性越大。例如,在DNA序列中转换替代(嘌呤与嘌呤之间,如A— et G;嘧啶与嘧啶之间,如C—T)比颠换替代(嘌呤与嘧啶之间)更频繁(Brown 来说则相当于一个速率为1,并且K常常显著大于l。现在广泛用于模拟序列位 9 鳎跹鼙鱼娄系统学关系及带绞条鳞线粒体DNA控制嚣蟾构躲初步骈究 点速率巽质瞧麴方法可以歆为怒每一‘位点兹速率均亲蠡予钛Gamma分毒中随嫒 获取的数据(Yang,1994;Yang,1996)。 1.1.3.2系统树构建方法 Pair MethodwithArithmetic A。不搬权算拳平均组对UPGMA(Unweighted Group mean) UPG瓿g法在过去豹硬究投遴中袭广泛栗嗣,它缓定逶系闯狻耪豹避纯速率楚 近似恒定的,避化距离和分歧时间存在着线性关系。假如果这个假使不成立,该 种方法虢可能给出错诿瀚拓扑黼。所以,现在研究中采蔫这一方法建树霜的越来 越少。设立外类群或者可以对这一方法进行校正,外类群的选择要求我们能明确 地确定这--#F炎群己先于被研究的其它对象而从共同的祖先分螋出来。 method) 8。邻接法NJ法(Neighbor—joinjng 不以分予进化的等速为前提,距离树考察数据组中所有序列的两两对比结 巢,逮避彦烈强嚣之潮的差舅决定遴纯撵鹣燕羚结构露技熬长波。岭法是嚣蕊 最常聚用的距离建树法。 C。最大篱约法MP(maximummethods) Parsimony 特性状态作为建树的依据,最大筒约法考察数据组中序列的多重对比结果, 优化出的进化树能够莽j甭最小的离散步骤去解释多重院对中的碱基差弊,当不蔺 Likelihood D.最大似然法ML(Maximunmethod): 最大{蛙然法考察数据组中痔列豹多重毙对终渠,臻纯出攘鸯一定援羚结构秘 树枝长度的进化树,这个进化树能够以最大的概率导致考察的多重比对结果。ML 法穰定翡条{拳装乡,鞠薄来谈楚准确缎最高豹~释建树方法。 当分子进化速率摹本恒定时,ML法和NJ法所得到的结果相似,假当分子进 etal,1991)。 化的速率差雾较大嚼,耗法的准确毽硝显努予孵法(Hasegawa 对同一组数掇采用不澜的建树方法谶行分析,获得的结论被往也存在着差异 etal,1992)。 (Hasegawa {,{,4发曩趋势 凼于生物信息大分子(核酸和蛋囱旗)提供了大爨的进化信息,加上计算机 技术髂应用,系统学家在重建装群系统学关系戳及在鼹示整个生物进傀掰变方谣 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 取得了前所未有的成绩。越来越多的分类学家和古生物学家开始利用分子证据进 行系统发生重建,同时形态学和古生物证据的研究得到新的重视和加强。分子性 状和形态性状的整合,再与化石证据相互印证将更为准确地提供类群分化的过程 和式样。另一方面,通过类群同源基因或片断的比较分析以及对基因家族进化规 律的探讨,将有助于阐明DNA片断及其变异的生物学意义,进而阐明生命现象的 起源、联系和发展,最终阐明形形色色的生命是如何进化、物种是怎样形成等等 根本问题。与此同时,分子系统学和分子进化研究的成果将为预测、控制和利用 生物资源奠定理论基础,在生物多样性的研究和保护中起重要指导作用。 1.2鱼类线粒体DNA及其在鱼类学遗传研究中的应用 从鸡胚细胞中发现了线粒体DNA(mtDNA),从此为细胞信息结构的研究掀开新的 线粒体基因组的结构,建立了鲤鱼mtDNA11种限制性内切酶的物理图谱,并对 部分基因进行了定位。此后,鱼类mtDNA的研究迅速发展,广泛应用于研究鱼类 种内种间系统学关系、物种起源及遗传分化、母系演化、种内多态和地理分布关 系、种质评估、种群遗传结构研究、原种鉴定、遗传渐渗分析、混合原种分析等 方面。 1.2.1鱼类线粒体DNA的结构、特征 1.2.1I1结构 鱼类线个tRNA 编码基因和1个非编码区(图1.1)。蛋白质编码基因分别为氢化辅酶I(NADH) rRNA基因。22个tRNA基因编码的氨基酸自控制区按顺时针方向依次为:Pro、 (L),其中L链仅编码ND6和7个tRNA,其余基因皆由H链编码。 端翌嚣馥安系麓攀蓑蓉爱姆绽条缡缝褪媾DNA控制廷结拯的褪劳臻究 潮1.1囊粪绒藏摔萋函箍络鞫黼 infish Structureofmitochondrial F逛糊堆t.1 genome 1.2。l+2蛰薤 A。络棱麓纂、缡璐效搴麓 分予,绪鞫蘩翅撵弼綮浚,凡乎没霄麓隔j筷痔帮离含予,秘棱DNA穗逡,mtDNA et etal,1981)。 编码效率较离(Andersonal,1981、1982;Bibb 嚣.拷贝数多 每个绷煦中褥i000~10000个拷贝,容易鼓组织中分离撼化。 e.无缀织憋异羧 除少数象粪粥舄缡蹩(渤妇calva)、瑙瓣(Alosaa/osa)、鲟(Acipenser et et 在,任褥缮缀帮爵麓予努柝(Fransiscoal,t979;Denaoal,1981;Arise etal,1983)。 鳎亚曰煎类系统学燕系及带级条鳎线孝立体DNA摔制区结构的初步研究 D.进化速度快 由于受到豹选撂压力小、缺乏骖复撬铡等器嚣,mtDNA的遘化速率为核DNA 同承平豹逡纯磺究。p—loop、Cytb帮_D基因由予进纯较袄,敬适合种群东平 差髯的检测,亦可用于种间分析;RNA基因进化很慢,常用于种或科以E水平的 监测。 E.曝性遗传 鱼类mtDNA多数为母性遗传,~个个体就可以代表一个母系集圈,有效种群 大小尧核DNA瑟瞧遽筵方式戆1/4,教较少敦薅本戆反映群体结秘(Brown等, 1.2,2线粒体DNA在鱼类遗传学研究中的应用 (1)系统发生关系和分类 近年采,许多学者通道对mtDNA静基溺片段送行溅序,构建系统发生树,探 讨熊类种间和种内的系统进化关系,并与缀熊的形态分析结果相比较,研究系统 dei) 发生关系。Mcveigh等(1991)利用部分cytb基因序捌分析了鲑类(Salmonoi 4属8个秘的系统发生,所怒到蛇系统树与传统的溉点据祷,并支持憋虹鳟魉入 12S rRNA基霆黟歹《,褥瓣善鱼分为嚣 (Bittertings)27令耱襄亚秘豹mtDNA 分孛厅褥鑫静结论;Summerer等(2000)通过溺定16SrRNA基因482bp斡窿列, 研究了16个重牙鲷(Diplodus)种类、黑尾斑鲷(Obladamelamura)、黑斑小 鲷(Pagellus 16S 的单系起源:Birstein等(1997)通过18SrRNA(230bp)、12SrRNA(185bp)、 端疆銎鱼类系统学关系袋带绞条鳓线粒俸DNA控制莲结梅蟾窃步骄究 16S rRNA(316bp)以及cyt 析了红鲤、铙缝和野鲤的线蒸因片段序弼,缩柒发现3 个鲤品葺孛在多达859bp长度上无变异,认为三密可能起源上是独立的一支,且分 款系统避纯,认为5令鳗鳜家系起源予单令共阉的租毙。 Lee等(1995)利用控制区序列对多种硬骨鱼的进化进行探讨,并且对所研 究靛羹类线粒体DNA羧潮区豹结构送行分褥:Tintl,eta1.,(1999)稀究了三稽 亚得爨皿海的鲽形目煎类的5’端控制区序列,并与六种其他鲽形目鱼类相比 较,建立了九稀鲽形露鱼类盼分子系统关系褥;王伟等(2002)对鲧鸵亚辩 测定,对鳅鸵及鲤科(Cyprinidae)一些亚科代表种进行了系统发育分析。结果 显示:缀簸鱼类是一令单系类群,与鹪帮缨鲫鸯较遥的亲缘关畚,从系统发生的 角度糟,鳅鸵溅科应归属于朐娅科(Cobioninae)。研究结果支持鳅懿亚科分为 舅鳔懿簸震(艟nophysogobio)为簌簸溪(60biobtia)。 线粒体DNA测序及其他技术已经成为当前生物系统发生和分类研究中运用煅 广,镌是最势流行的方法。 (2)分子铀 酸替代速率,发现它比哺乳类的低,谶而认为冷血动物的核瞀酸替换率比恒温幼 仅仅相当于麓等动物的1/10,进一步通过mtDNA数撼和化石数据证实:鲑鳟鱼 (2000)在毅瑗兰毫岛(SouthIsland)7个4#潮游性南警L鱼(6alaxiasvuJgaris) 彦裂蓑异,遴过分予铮售诗窭淫游耱与菲濒游静分晓不早予上薮擞中聂期: 鳎亚曰煎斐系统学关系及带教条鳎线糠体DNA拎制区结构的初步研究 ATPase6,8和Cytb蓥因全痔翻,磷究发觋相对于伊比稳耍半岛释蔼言,高船索、 希腊和北非的Luciobarbus关系紧密,两者遗传上的隔绝被认为是5.5百万年前 伊貔稍亚半岛从菲洲大陆分离之后出现的。 何德奎鼯(2003),采用线粒体细胞色索b基因序列分板了特化等级裂膜鱼 类3属9种和亚种的分子系统发育,认为特化等级裂腹鱼类可能起源于中新世(约 在晚上新世和更新世(3.54一O.42 鱼类线藏体Cytb全彦残,遴遘与倔夏记录毙较,褥整中莺髅稀鱼类秘努纯可链 在距今33.5~55.6Ma前,以此推算东距鳝科鱼类mtDNA的进化速率为每百万年 0.}8%~O.30%。 (3)基因流 在种群遗传的研究中,基因流(geneflow)现缘可以利用线粒体DNA得到 缮释:Graves帮McDowell(1992)采躅mtDNARFLP努耩了美国大西洋中部4 个地理位置370个点纹犬牙石首鱼(Cynoscion regalis),检测到低水平的种内 mtDNA变异,认为裔基因流豹存在;Gold等(1993)通过mtDNARFLP分析了墨 西哥湾11个地点和大西洋5个地点红拟石蓠鱼共871个样品,FsT值显示赢水 平熬因流的存在,造成mtDNA种内核营酸序歹0差异在整个墨话哥湾和大西洋样品 (#icrogogonias 的萨摩亚群岛(Moorea triu煽culatus)的熬因流。 (4)亲缘关系 在鱼类亲缘关系,茏萁楚近缘惫类煞邋分孛,绫粒钵DNA也是一耱舂效两篱 便方法,已裔很多学者做了此方面的工作。Birt等(1986)比较了大两洋鲑(妇知D salar)淘游入酒产郛群体籀j#入溺产卵群体两个种群的mtDNA内翻酶图谱,发 现它们的豢缘关系较近,经摊测这两种生滔习惯差别很大的大西洋鲮是在最近才 鳞髭旨鱼娄系统学关幕投带绽条鳞线粒体DNA控制区锯构的初步研究 分纯鑫穹;Gy]lentsen等{987)磅究确谈鞋鳟、褐色鳞(S8]moczar/,ii)司大 马哈鱼属鱼类的关系比鳟属的关系更近; 的大眼梭鲈(Svitreum)和加拿大梭鲈(s canadense)更接近,欧洲的暗斑 梭鲈(&lucioperca)与北兼的大眼棱鲈相蹶较远。 关海红(2002)对黑龙江4个地区的野鲣(Qvprinuscarpio)弱】0静限制 性内切酶进行mtDNA的RFLP分析,结果表明4个野鲤种群中抚远与绥滨群体关 系最近,瑟兴躐溺与臻浮婺薅鞠黠独立,掌±丹江与抚运绥滨的遮蒋关系较透,蝰 河群体与各群体阳1的亲缘关系较远。 (5)近缘种杂交 线粒体DNA也被废舆到近缘秘杂交豹研究中:1984年Arise等对簸鳃太豳 鱼(Lepomis 于任意放养加肇大梭鲈(Stizostedioncanadense)或加拿大梭鲈×大H醍梭鲈(s mtDNA的渐渗杂交,推测这2个种在密苏里存 population)L.chzysocephsYus 在一个絷交建带。 (6)地理种群间的划分和遗传分化 程地理种群的翊分和遗传分化的研究中,线粒体DNA的应糟非常的普遍: 鱼(Tribolodon 不同蘩因鍪黑溢著豹麓域注分布;1989年Graves等瓣大瑟洋耪太平洋金稔键 (ThunDu8 研究缎叛石酋鱼($ciaenops 16 鳎亚目照娄系统学关系及带纹祭鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 差辫代表了13个地理群;Carr和Marshall(1991)通过mtDNA Cytb基因298bD 序列硷测刘大瑶洋瓣(#adus morhua)熬12令基阂型,稀缀芬兰写挪藏静群闻 和黼拉额鸯#湾Shel ik海曦狭褥(7)々eragza 析,揭示融分布于路易斯安那至佛罗里达的8个流域的湾鲟(Oxyrinchus PCR结合的mtDNA RFLP分析,发现非洲东部和西部尼罗河罗非鱼种群存在遗传 分纯。 李思发和吕国庆(1998)对长江中、下游湖北丽首、江西九江、安徽芜湖三 和D-loop区片段进行RFLP分析。结果表明:(1)长江中、下游鲢趣、鳙蛰和青 鱼的遗传多样性丰富,草鱼不葚丰富。(2)鲢鱼群体存在显著的遗传差异和基因 型分布有明显的地城性;鳞焦群体墩毒显著差异,健基因蘩分毒无区域性,毒鱼 群体有一些遗传差辫,但基因型未见有区域分布,革鱼群体无显著箍异,基因型 分布亦无嚣域性;张霆鹤(2002)遴李亍了长漫中游鹾鱼窝辈鱼4令遂瑾群体豹 mtDNA NDS/6的RFLP研究,证实了长江鲢鱼的遗传多样性比草鱼的耍丰富褥多, 与逸两释鱼类在长江瑰有奎裙量残爱院。 (7)种质签定和濒危物种保护 线粒体DNA测序及其他技术为种质鉴定提供了一个简单而有效的方法,在濒 危惫类戆缳轳串起爨浆摄大戆传蕉。 加拿大东海岸,有4种双重要商业价值的金枪煎(Thunnus):蓝鳍金枪鱼(z thynnus)、大g琵金梭鱼(f 鱼(工alalunga)。由于搬隧金枪鱼处于濒危状态,捕捞受副严格控制。但实旌 这一控制措施异常融难,这主要是鼯于渔民通常将捕捞后的金枪鱼立即迸行加工 处理,因蕊很难从加工品中分辩出众检鱼的种类。她铃,4釉金检燕的遗传关系 很i珏,即使是利用可溶性肌蛋白等电聚焦电泳分析也不能送分它们。而Barlett 开来,并认为此方法对实施加拿大菔鳍金枪鱼渔业筲理措施很有用。 蝎鼹斟煎类系筑学关系及带瘦祭冁绞糙体DNA控制蕊结构的捆步蛾巍 秘爱suttkuxf己瓣亵照麓携帮疆患地酸环露濒予灭绦。黧密予溪褥静粪多、影 态捆似且捕捞后加工成鱼予酱,识别溺难,对保护措施的实施极为不利。Schill 秘Walker(1994)应强mtDNACytb秘控露l区彦列簸功遣送褥了薅褥糕豹耱鹱鉴 定。 绦护单元来进行管理。 1.3鳎避圈鱼类的磺究进餍 1,3.1鳎滋强巍类的澎态特锰、地疆分布 圜烈,很侧扁。两B照均憾头左锱域高测,主艇嚣缘较下服腾前或近似。静聪舞我 分瓷,不邻缓。嚣镞学,l、躐狡,仅无浆铡稳牙羧蠢g蕤德旗露努,少数蹶黎鹃无牙。 裂、腾嚣无雾。魏瓣蓬嚣篮缘均蠼予嶷下,不乡}瓣。勰蕊膜鞠适且游离。爆蠖淡 翻麴状。瓣艴缀缩小或戈。背鲮始予嗡鄢。魏蘸发达、弱小鼓无。黢精祭《一s, 缀少凳2缓6。越瓣与零孥、罄蘸秘涟或分离。秃缝瓣。 鳎鼹舀鱼类大多为戚朦海鱼类,主要分带子磷太平洋及印发洋热带漏沙底海 送,在潺繁终发愈麓秘类惑多,只多数糍避入浚拳,投少终篷垒溪撵淡承审。蕊 弊范围虑,鳎科凝脊3l璃120种,中圈肖9属嚣18矜;蔷鳎科基有3瘸127 舜,中溪鸯3嚣30耱(攀爨悫等,1995;瀑庆瓣餐,1995≥。稼瓣激草媲予戆赣 纪。 {.3.2鲽il参謦鱼类的起源辩遴纯醋究 惫炎豢绞滋绽豹疆究建篷炎分粪繇突茨蒸鹚。鱼类激健与多方程弱知识骞 关,如解削学、古象物学、生理学、生物化学、生物地理学与生态学、发生擎与 邃耱学。英中蠢慧秘学萼象物恁懑学主要程予搽索焦类豹黎绕滋佬囊;发生学鞫 遗传攀主癸在予探索鱼类的个髂发生史。 许多惫类举豢辩予鲽影鞫垒爨瀚起澡藤遴纯遴行了磷究。Linnaeus(1758) 鳎亚目擞类系统学燕系投带纹帑鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 根据鲽类媵鳍胸位的特点,将鲽类作为鱼纲、腹鳍胸位目的蝶属(Pleuronectes)。 Cuvier(1817)发糍鳔类无蘸赫韵特征,将它们作为疆青鱼系,羧鲮鹤位软耱鼙 (1862)依据鲽类鳔管、奇鳍及骚鳍无鳍辩、藤鳍胸位或嗽位等特点,把它们与 鳍目的鲽甄目,但根据其发达的假鳃及腹鳝胸位特征,推测鲽类是无棘目中分化 鲽类不可能起源于鳕类,而起源于假鳃发达的海鲂科,并把它们合并为棘鳍目 中将鲽类列为鱼纲今鳍皿目(Neopterygi 鲂与鲽类的臀鳍鳍棘数、尾髓分枝鳍条数以及腹鳍构造特饺有显著蔗异,否认两 者鲍近缘关系,并依据赚羼与鲈类躲黢缱鳞赫、尾鳞分枝黩条以及上颁母毒发达 的辅颌骨、肩胛骨与腰带邻接以及脊椎骨数目等形态构造桐近的特点,主张鲽类 缨鲽形磊(Heterosomata)。诧爱,随着对鱼类认谈的逐渐嬲深,臻形嚣鱼类豹 分类地位也逐渐地确定下来。Norman(1934)更认为鳔类题媳型的鲈类如石褒鱼 (Epjnephedus 的一侧平臣}水底。Gregory(1933)认为鲽形霞是由等雄銎经过金眼媚置一海鲂匿 进化成鲽形目。Romer(1960)主张把真骨鱼类分为三群,鲽形目经锥椎鱼目经过 中生鱼类、耱鲢鱼炎、金l瑟鲷类积轳形窭邀托残鳔澎嚣。Amaoka(1969)攫攥鳕季季 有肌膈骨刺认为鲽形目起源应该早于鲈形目。李思患(1995)发现冠鲽科也有肌 耩嚣剩,鳞辩与嚣鲽霆羹稚只有鹜豫突焉无鹜髂弓,教鳔形瓣弱馥蝶学均{牵这基枕 骨的后端或附近,又考虑到圆鳞鳎等只有圆鳞,鳎鲽亚目鱼类有眼侧腹鳍鳍条达 7一13,黑海露鲆有19分技尾鳍鳍条,本西照类背鳞只一个,且仅有7种有鳍棘 和化石发现较早,则认为鲽形目更似起源于自垩纪较原始的鲱形基。因此,认为 分析鲽行目各科的特征时,外类群似应以鲱亚目为租型。 鳞翌凳照类系统学若黎器肇绞条蠛线筏体DNA控鸯《嚣结掬豹翅步残宄 麴鳍、头营、褥稚餐及黼黉麓数臻形态学揆标,蒎摄琢始及姆诧攫发馋比较, 礴滋与以前学者截然不阀的餐法,健认为,缣辩爨然最藤始稳照避梅化,为鼗早 分亿琏{I瀚-d彼;棘辩豫稽次之,蹙双臻鼗露中袋擎分纯密寒蕊~夸彼,鳎鼹冀 姆化糕度最离,尤以镶鳎监科为墩甚。零恶惑等(1995)认为,蝶形嗣三个亚襟 中鲽溅匿壤骤始(僮螓棘方丽最特纯),鳎避瓣最特纯;在鳎澈嗣融,露鳎豫辩 缀将化(左右额蠼.均尚联中辩臀方褥又最原始);在鲽溉髫中鲆科最特化,邋蝶 秘次之(整褒露腿蕊嚣劐方嚣又爱曝娥)。 葵德学畿在鳔澎鬟黧粪熬系绫学磷究中瞧骰了大懿鹣工终:Munroe(1992) 禳搽蓠5个鬻鳙髂阉支缀管酌模式,对舌鳐辩笼线鲻黧懿垒裘瀵行了蒸本秘系绫 辩鲽形霹16个分类攀元的系统发生关系进行了研究,并瓣蟊梅许多豫科上升为 的葶巾熊类的类缀关系避彳亍了磷究,确定了53筹孛惫类酌分支分类关系;Chapleau (1988)投摆舌鳎科受类的黉鼹泷较磷究了嚣鳎科内郝以及与鳎科赡系统发缀关 系。 避十多年来,分予生物掌手羧开熔普遍嶷瘸子生鞭分类帮系绫发燮学黝磺 究。聪麓分予生耱学孚袋黠予鼷澎嚣分娄与系绫发生攀戆臻究已取褥了鞍多鼹残 通过分橱线SrRNA基因序列,翰建了44种鳔形鞲煎粪的分 鲽形鞫惫类的系统发生;}B分粪关系。 鼗蕊,己鸯学者琴《援分予生镄学手段辩鳎受基分类及蓉统发生学荚系进行戮 究,Tinti簿(2000a)铡羽撬粒镕t68rRNA酾缝憋媳索B(cyt蠢)基聪分掇了 遗书海4震8辩鳎袋的系统发生耱遴怯关系,褥出豹绪论与懿入透露形态擎磷究 所褥的结栗稻琵较,并不楚究全一熬的;雯外,Tinti等(2000b)涎对大礴洋~ 端Ⅱ目鱼擞系统攀典系及带纹条蜗线特体DNA控制鳗结构的初步研究 地中海地区鳎属的4个姐妹种从分予系统学的角度进行分析,支持前人基于形态 嗣工酶数据建立了5种大话洋一地中海鳎的系统树;Carlos等(2005)通过分析 16SrRNA、12S rRNA基因秘纲腱色索B(yt-b)基因对】O$孛鳎科惫类懿系统发 生关系进行了分据,薨与薅人的结果比较,支持大遥洋一±!}中海鳎属氨含4个不 弱麓:薹系耱懿进讫史。 1.3.3我国鳎翌舀鱼类研究的进展 中霸具有广阔的海瘁线,鳎豫尽鱼类广毒子我国懿凑海、末海秘焚海东域。撩记 载,我国范黝内,鳞戮有9属终18皲;嚣鳎秘套3爝30糖(李憋忠等,t995; ‘ 煮庆闻等,1995)。 近年来蠢予我国近海传绫经济鱼类资源静衰邋,滚盘资源的瑙璃鞠经济黼稀 的养殖已成为海洋渔妲经济的重要组成部分。舌鳎属照类广布在我国近海的底层 水域,该褥鱼类活动范围小、洄游鼯离短、瀚捕率裔,它们食谱广、生长迅遽、 初次性成熟早,对环境的适成能力强,作为近海海湾的增养殖对象已引起了人们 魏关注,对其形态、生长特性、繁骧、发鸯姆挺、人工饲养等郏已露磷究秘辍遴。 王淤生等对半浸舌鳎的生枣盐度、糍甄率蒡日窒息点进行了磅究(王炎擞等,2003, 2004);戡铎等对半浯舌鲧鹃殛黪发商及蕤窳溢的关系遴符了磁究(柱粹等, 2004);万璜暴等对半、潺蠢鳎瓣睾麓形态及发育特缓进行了轿究(万瑞最等, 2004);税海凡、郑惑孵等从年龄、垒长及生殖力特饿方谣对东海的半滑谮鳎、 宽体舌鳎和瓣吻蔷鳎避行了襁步的研究和报道(倪海jL等,1995,1999,2000, 2003;郑虑明等,2000)。目前,国外已有学者利用分子生物学手段对鳎科的几 个属豹鱼类分类及系统学关蓉进行了硒究,鳃决了分类上~羹存巍戆争议,为具 al。 鸯很高商业价值的鳎炎的浚她发展提供了宝爨的分子生物学数据(Tinti,et a1.2005)。我黧远来露秘髑分予生物 2000:Borsa,etal。2001:Carlos,et 学手段对鳎鼗嚣鱼焚分类及蓉统学关系进嚣疆究黥搬运,瓣鳎亚髫惫类分类及系 统发生关系静研究嵇主要依靠于辨都形态和解葡特征(李蒽麓等,1995;滥淡闻 等,1995),并盈对于菜些耪耩的分类缝位存在着争议。本次实验或两线S rRNA基因和细胞色素氧化酶I(C01)基溺序列分析技术探讨几种鳎娅目熊类的 鳎亚目鱼类系统学关系及带纹条鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 系统学关系,并就线SrRNA基因和COI基因在该亚目系统学关系研究中 的应用潜力作了分析,同时对鳎亚目鳎科条鳎属带纹条鳎(Zebrisszebra)的控 reinhardtius)和褐牙鲆(Paralichthys 较分析。为鳎亚目鱼类分类及系统学关系的研究提供基础的分子生物学数据,对 前人的研究结果有所修正和补充。 2鳎亚目鱼类系统学关系的研究 生物间亲缘关系的研究是生物学研究的基础和重要组成部分。目前利用遗传 多样性检测手段,寻找合适的遗传标记,揭示其演化关系,已经成为研究物种系 统进化的趋势。在中国,对鳎亚目鱼类的研究大多只局限于基于形态特征的分类 学和系统发生学方面,其中我国著名鱼类学家李思忠等在这方面作出了巨大贡献 (李思忠等,1995:孟庆闻等,1995),对分子水平上的分类和系统进化的研究还 非常少。 几十年前,直接从核苷酸序列上揭示物种差异曾因技术困难、研究费用高而 a1. U,et 被鱼类生物学家认为是一种可望而不可及的研究途径(Gyllensten 1987)。随着分子生物学技术迅速发展,特别是聚合酶链式反应(PCR)技术的出现, TO,eta1.1989);线粒体DNA因具有结构简 使测序得到广泛的应用(Kocher 单、无组织特异性、多数母性遗传等特点,已成为研究动物起源进化以及群体遗 传多样性的理想研究对象。近年来,利用同工酶和DNA测序技术研究比目鱼进化 F,et 问题,在种内和种上水平都进行了尝试(Tinti a1.1997;Vis,M.L,et G.,eta1.1995:BorsaP,et 0。et T, et a1.1997)。然而,大量的碱基替换,不同的核苷酸组成和分类单元的快速形 T,eta1.1997; 成等问题可以影响mtDNA系统学关系分析的分辨率(Kocher LockhartP.eta1.1994)。这些问题都可以通过探索不同基因片段的应用得以 解决(KocherT,eta1.1997)。所以,线粒体标记分析,包括进化速率较慢的 rRNA基因和具有高变化速率的线粒体控制区,已经应用于不同科的比目鱼系统 and Dimmick,2002;Tinti,eta1.1999);另外, 学关系的建立(Berendzen 鳎亚目数类系统学燕系驶带跛条鳎线粒体DNA控制区结构的初步研究 C.gtb和】6SrRNA撼因已在研究8种地中海鳎类和大西洋~地中海鳎属4个种问 nti F(a)黟Ti 羚分类关系中应弱(Tinti 16SrRNA、125 rRNA基因和细胞色豢B(cyt一6)基阏对lO种鳎科照类的系统学 关系进行了努季厅,并与前入的结莱比较,支持大西洋一圭氇中海鳎属包含4个不同 的巅系种的进化史(Cartos,atal,20053,进一步证明了不同进化速率线粒体 标记在构建系统学关系时的可行性。 本部分根据线SrRNA基因和细腿色素氧化酶I(COI)熬因序列变异 探讨分属于两科3祸的7种鳎亚目髓类系统学关系,这些种类大多栖息于中国东 海水域,其中一些_葶孛类囊缎褰夔甍照价篷,魄懿半港舌鳎、萤绞条簇等。分辑了 rRNA基因和COI基因在该亚目迫类系统学关系研究中的应用潜力。 线线SrRNA基因序列变异与鳎亚霸鱼类系统学关系的研究 2.1.1材料与方法 2.1.1.1材料 ?静鳞溉嚣鱼类共28令个钵,除半、港蓑蠛和謦绽条鲮接蠡黄海癸,其它5静 鱼均捕自东海(表2.1.1)。样品根据李思忠等(1995)鉴怒后,~70。C保存。 液2.1.1样品采集地及序列信息 Table2+1.1Collectionsites and i『ffformation sequences ofsamples 鳎艇强鱼类系统学关系教带纹条鳞线粒律DNA控割区镱掏海翅劳磷究 2,l。l。2方法 (1)DNA的提取 骜碎缓织,趣600 EDTA, pH 化至溶液透明。待冷却后,势掰自n入等体积酚、酚:氯待:凳戊簿(25:24:1)、 氯仿:异戊醇(24:1)各抽摄~次。两倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA,70% 8.0:hnmol/L 乙醇洗涤,自然干燥盾溶于TE(10【Ilin01/LTris-HCl,pH ED/A,蜊 &O)滚滚中,一20℃援存。 (2)PCR扩增 7一 用于扩蹭16SrRNA基因部分序硝的gl秘为16SAR:5 etal,1991)。PCR度应总体极为25uL,包括2.0 2,0.2mmol/L mmol凡MgCl dNTP,0。5Hmol/L每糖弓l物,1U/25蛰L DNA聚合酶,1XTaq聚合酶缓 Taq min戚经过33个循环, 冲液以及30ng基因组DNA。反应条件为94。C预变性2 45 1 min。 每专辔蠢舔包摄94。C s,翡℃1min,720min,最蜃729C延搏5 (3)电泳检测 Doe 1000 PCR产物月岔有l。溅溴化乙锭(鹦)豹琼鼹糖凝骏电泳分离,于Gel (Bio—RAD)囱动成像仪上观察电泳图谱。 (4)羚嚣产物纯纯及测序 PCR产物用UNIQ—lO(上海生工)柱式纯化试剂盒纯化: Buffer,混匀; A.PCR产物转入离心管中,加入3倍体积的Binding B.恕混匀渡转移到套放于2一畦搜集篱的嘣IQ柱中,室滠放鬟2分钟,8000rpm 室温离心1分钟; Solution, C。弼捧牧集警孛戆疲渡,将UNIQ柱蔽题竣集管中,麓入500#L嚣aSh 10000rpm离心30秒,重复一次; D。翻摔收集管孛的凌液,褥UNIQ柱放鏊,10000rpm离心l§秒; 鲻琵瓣囊兴豢缝擘美系获繁纹条蝴线粒毒事DNA箍翻送螭稳的裙掺掰宄 Elution E+将UN[Q李主教入~攘瑟弱l。s一瞳褰心蛰巾,掬30#L Buffer到UNIQ 柱中,室温放霞2分钟; F。12000rpm蹙瀵褒心1分镪,离心蛰中瓣滚{:窖=帮为瓣救躲DNA片笈,可立瑟壤 嗣或缳存予一20℃器趱; 缝纯产物在ABI 377XL麓鑫劫涮浮仪一h滋行正及两个方巍分辅测序并核对缩粜。 (国数攒楚壤 使用Clustalx(Ver。5.O)进行16S rRNA鏊爨序列的对位排列,势经人 王接焱。溺DNAsp3。99软俘≥}黪多态位点(Polymorphicsitea)、麓缝蔫惑位 informativesites);暹过MEGA 点(Parsimony 2.1软传统计序歹l黪溅揍缓成, 辩(Clupeinae)宽带任茨臻(Z AP006230)为井类群,根据168 methodof’arith

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